選自中華檢驗醫學雜志, 2018,41(5)

作者：肖林林 楊德平 魏取好 劉維薇

近年來，分子診斷領域的發展遇到前所未有的契機，加之國家相關政策的制定與傾斜，更使其蓬勃發展。分子診斷以其快速、靈敏、精準的特點在疾病發生、發展、預后等各個階段均可發揮一定的作用而使其在醫療行業中得到了較廣泛的認可。

 

一

分子診斷及分子診斷自動化概述

分子診斷是應用分子生物學的技術和方法獲得人體生物大分子及其體系存在結構或表達調控的變化水平，為疾病的防治、預測、診斷、治療和預后判斷提供信息和決策依據的新興的檢驗醫學分支學科^[1,2,3]。自20世紀70年代起，分子診斷領域的研究異軍突起、方興未艾，其迅速成為體外診斷最重要的領域之一，是體外診斷領域中技術要求最高、發展最快、最富有挑戰性的一個分支^[4]。分子診斷的發展史可分四大階段：1978年，簡悅威等應用液相DNA分子雜交成功地進行了鐮形細胞貧血癥基因診斷，標志著分子診斷的誕生；到1985年，Kary Mullis博士發明PCR技術，標志著分子診斷進入了第二階段；1992年，美國Affymetrix公司制造出第一張基因芯片，標志著分子診斷進入生物芯片階段；2005年，454 Life sciences公司推出基于焦磷酸測序法的測序系統，開創了第二代測序技術的先河，分子診斷進入精準檢測的高通量時代，應用范圍進一步擴展。

國內分子診斷技術的發展歷史依然遵循著世界分子診斷發展的大方向，大致分為以PCR技術為基礎的萌芽階段，以實時熒光定量PCR技術、芯片技術為基礎的發展階段，以及以高通量測序、微滴式數字PCR和液體活檢等技術為基礎的黃金時代三個階段^[5]。常規體液標本逐漸被賦予新的內容，循環腫瘤細胞(circulating tumorcell，CTC)、循環腫瘤DNA(circulatingtumor DNA，ctDNA)、外泌體(exosome)等遺傳信息載體的發展日新月異，令人充滿無盡的遐想^[6]。目前國內分子診斷主要涉及的技術平臺及其應用領域具體見表1。

表1 國內分子診斷主要涉及的技術平臺及其應用領域（點擊看大圖）

 

分子診斷自動化即全自動化集成式的分子診斷系統，主要包括樣本采集、樣品處理(細胞濃縮、細胞破碎)、核酸提取(DNA/RNA分離等)、基因擴增、產物檢測(實時熒光定量、核酸雜交等)等檢測過程。由于分子診斷中樣本預處理過程復雜，常需精確的溫控系統，手工較難實現，分子診斷自動化系統便應運而生。其以通量大，重復性好、高效、封閉體系防污染、可實現精確的溫控及復雜的預處理過程，對實驗場地要求不苛刻等優勢而備受關注。

 

二

分子診斷自動化系統的基本組成

及其應用現狀

1．分子診斷自動化系統的基本組成：

依據功能分為3部分：樣本前處理系統、檢測處理系統和分析處理系統，各個子系統由相應的軟件和硬件緊密結合而成。系統涉及的關鍵技術包括：樣本提取和處理技術、目的分子的獲取與放大技術、信號檢測技術和數據分析與人工智能輔助診斷技術。

 

 

分子診斷自動化的發展程度與儀器實現自動化檢測過程覆蓋的范圍密切相關，若將樣本前處理自動化系統稱之為分子診斷自動化的1.0時代，那么樣本提取檢測一體化系統可以稱之為分子診斷自動化的2.0時代，樣本提取檢測分析一體化系統可以稱之為分子診斷自動化的3.0時代，期望可以實現分析全過程的自動化處理，此外還可以利用人工智能實現報告綜合分析自動審核、輔助診斷、個體化診療方案及預后提示、自助進行臨床大數據分析及疾病建模研究，我們姑且稱之為分子診斷自動化的MAX時代。

 

2．核酸提取的應用現狀：

分子診斷研究的靶樣本種類繁多，包括核酸、蛋白質、外泌體、細胞、組織等，臨床分子診斷現階段的研究對象集中于核酸。核酸提取技術是其涉及的關鍵技術之一，除包括常規DNA、RNA提取外還包括、ctDNA、血液游離DNA(cell-free fetal DNA，cfDNA)、微小RNA(micro RNA，miRNA)等特殊靶樣本的提取，從樣品中提取核酸的方法有很多種，其中，磁珠分離法是目前應用最廣、運用于自動化處理系統中最為成熟的一種方法^[7]。由于ctDNA、cfDNA在外周血中含量極低，因此對于提取、檢測技術有很高的要求。目前ctDNA、cfDNA的檢測主要包括分離富集和檢測。富集方法包括梯度密度離心法、過濾法和磁珠法(最常用)，檢測方法包括免疫學相關技術、反轉錄聚合酶連鎖反應技術、酶聯免疫斑點技術以及芯片技術。分離提取miRNA的主要方法有：差速離心法、超濾法和免疫親和層析法，各有優缺點，采用多種方法聯合應用分離提取miRNA，可提高產物純度，穩定生物活性。

 

3．國內外分子診斷自動化系統的應用現狀：

1980年世界上第一臺臨床自動化樣本處理裝置的投入使用，標志著臨床實驗室正式步入自動化時代。隨著時間的積累和技術的滲透，臨床分子診斷自動化拉開序幕。目前已面世且獲得CFDA及FDA認證的各平臺中，樣本提取檢測一體化平臺僅有羅氏公司推出的cobas® AmpliPrep/cobas® TaqMan® with Docking及cobas® s201全自動核酸血液篩查系統兩款產品，基本實現了"樣本進、結果出"的效果，因為實驗全程*作標準化、空間封閉，故可以做到低污染、高效率、高重復性，但平臺兼容性和可擴展程度較低，檢測項目有限。國內分子診斷自動化產品的開發起步相對較晚，目前還沒有國內公司推出具有自主知識產權的樣本提取檢測一體化產品。國內分子診斷設備公司為尋求自身發展，但苦于資金和技術等方面的限制，大多選擇和國外領先技術公司合作，以期在國內迅速占領市場。博奧生物等公司先后推出過自動移液工作站、核酸提取儀、PCR儀等臨床分子診斷類產品，一定程度上填補了國內空白，但自主知識產權或技術含量不高、功能單一、市場占有率低是不爭的事實，需要再接再厲。

 

三

分子診斷自動化主要技術參數

絕大部分公司推出的分子診斷自動化產品均主要集中于樣本前處理階段，就目前階段而言，無論是國內還是國外發達國家，分子診斷自動化仍然處于1.0時代，故以下我們將集中闡述樣本前處理自動化系統的技術特征。

 

樣本前處理系統依據其功能的豐富程度又包括自動移液工作站和自動核酸提取儀兩類平臺。自動化移液工作站是一種全自動、高精度移液系統。專門用于小體積的PCR/qPCR體系配置，能夠完全替代手工，保證了配置實驗擴增體系的正確性，精密度以及重復性，但是因為功能單一，臨床及科研應用局限。自動核酸提取儀是集成了自動移液工作站和標準耗材，在儀器預設程序控制下進行核酸分離的儀器，這一類自動化系統在科研和臨床中應用最為廣泛，目前評價分子診斷樣本前處理系統的主要參數見表2。

表2核酸提取儀技術參數一覽表（點擊看大圖）

 

四

分子診斷自動化的發展瓶頸

分子診斷自動化系統看似完美，實則也有制約其發展的缺陷和瓶頸，主要體現在以下幾個方面。

 

1．分子診斷自動化系統的技術瓶頸：

核酸提取過程的精簡化造成的檢測結果的保真性及可信度降低是分子診斷自動化的技術瓶頸之一。向自動化發展的過程中，檢驗流程的精簡化需求促使核酸提取過程的簡化，導致核酸樣本中后續實驗抑制物殘留增多，實驗效率受到影響，結果保真性及可信度降低。

 

2．平臺的開放性、兼容性不夠：

目前市場上開發的各種分子診斷自動化平臺之間壁壘森嚴，不同廠家之間的產品不能兼容，配套的非試劑類耗材的成本居高不下，自動化平臺還沒有形成統一的行業標準等。

 

3．樣本檢測通量有限：

雖然分子診斷領域出現了諸如基因芯片、測序技術等高通量技術，但樣本檢測通量和傳統的生化、免疫類自動分析儀相比較相距甚遠，嚴重制約分子診斷自動化的發展。

 

4．國內相關法律法規的制約：

國家衛生計生委已經發布了《醫療機構臨床檢驗項目目錄(2013版)》和《非營利性醫療服務項目(2013版)》，分子診斷收費項目包含齊全，各省也已頒布或正在加緊制訂收費標準，但是項目收費標準制定相對于分子診斷技術的發展還稍顯滯后，收費規定不盡合理，比較籠統，不便于臨床實際執行。其次，即使目前有明確清晰的收費標準，醫保部門聯動響應力度不夠，導致患者存在檢測費用的醫保難以報銷的制約。收費標準和醫保措施限制了分子診斷及分子診斷自動化的應用和發展。

 

5．軟件不匹配、不同步：

分子診斷自動化領域硬件平臺趨于同質化，功能齊全、處理能力強大的配套軟件可以達到全程可視化、管理科學化、工作高效化、結果共享化、成本控制化等效果，可能會成為搶占市場有力的武器。分子診斷自動化系統配套的軟件可以分為三個部分：人機交互及機電控制軟件、運行管理及數據采集軟件、數據存儲整合分析軟件，分別與分析前、中、后過程的硬件配合發揮作用。前兩部分技術含量不高，目前應用廣泛，第三部分主要用于自動化質量控制及智能化判斷、采集的數據進行計算和輸出，甚至是進行生物信息學分析進而做出個體化檢驗診斷提示、構建基于網絡的智能分子診斷平臺進行人工智能輔助診斷和對大數據分析進行臨床研究等，目前處于探索階段，其技術含量最高，應用價值也最大。

 

五

分子診斷自動化的展望

1．人工智能：

近十年興起的微陣列芯片和二代測序等代表性技術，已經成為一種重要的分子診斷工具，為這些代表性技術的產生和發展提供強大支撐的學科就是人工智能。人工智能對分子診斷領域發展的具體影響已經或將會體現在以下幾個方面：(1)快速篩選相關疾病更加有效的診斷靶點；(2)使分子診斷結果更加高效、快速、準確和可視化；(3)優化計算方法，提高測試重復性和精密度；(4)大數據與分子診斷預測；(5)模型重建與結果的深度解讀和挖掘等^[8]。

 

2．POCT：

分子診斷自動化行業呈現出"戰國爭霸"的局面，但結合POCT的分子診斷繼承了自動化系統優勢的同時，解決體積大、流程繁雜的缺點，在未來的分子診斷領域必將獨領風騷，原因有以下幾個方面：(1)個體化、快速化、樣本少量化、裝備一體化、床旁化、設備小型化、手機化、APP軟件化特點的POCT式分子診斷是大勢所趨；(2)芯片技術在POCT上的應用使POCT式的分子診斷臨床優越性突出，領域越來越寬；(3)國家政策支持：科技部、衛生部制定的專項規劃中均明確提出"積極發展現場快速檢測儀器(POCT)等新產品"；(4)POCT市場規模不斷擴大且保持30%的高速增長，預計到2020年產業規?？蛇_1200億元，將進一步催化POCT與分子診斷的整合。

 

3．精準醫療：

談精準醫療離不開精準診斷，分子診斷是實現精準診斷的重要方法和途徑。精準醫療為分子診斷及分子診斷自動化帶來的機遇主要體現在以下方面：(1)我國精準醫學研究計劃的實施為該領域配套研究提供了政策支持；(2)分子診斷自動化是一個涉及多專業多行業的復合型應用平臺，巨額資金的投入為相關學科和技術的快速發展提供了有力保障。

 

4．行業技術水平：

技術層面的發展將呈現出"統一化""集成化""微型化"的態勢。"統一化"指的是從行業層面制定規范、統一、適宜的行業標準。CLSI已經開始致力于制定分子診斷自動化設備的行業標準。"集成化"和"微型化"是利用微電子、微流控等新興技術達到使系統空間上縮小集成，功能上放大可擴展的效果，多學科交叉、高含金量技術疊加是必然趨勢^[9]。

 

5．行業管理水平：

管理層面所面臨的問題主要在于管理體系的制定、完善和實施，完善體系，分子診斷蓄勢待發。隨著國家政策的不斷完善、衛生監督部門對分子診斷重要性認識的不斷深入，管理水平的提升也會使分子診斷自動化在未來出現革命性的進步。當前發展階段解決問題的關鍵是在規范各項規章制度的前提下，建立國家和區域標準化分子診斷實驗室和標準化自動化*作程序(包括分析前、分析中、分析后)，盡早制定出一個符合中國國情的分子診斷自動化監管體系^[10,11]，使我國分子診斷事業朝著健康有序的方向發展，更好地為臨床患者提供高質量的分子檢測服務。